Общий анализ крови (ОАК) предоставляет клиницистам важнейшую информацию, так как характеризует физиологическое состояние организма, изменяющееся под воздействием различных внешних и внутренних факторов, и является неотъемлемой частью диагностического процесса и последующего мониторинга на фоне проводимой терапии.
В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H. Wallace и Joseph R. Culter в 1947 г. Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются. Если в один и тот же момент в канале находятся 2 клетки, то они регистрируются в виде одного импульса, что приводит к ошибке в подсчете клеток. Во избежание этого производится разведение пробы изотоническим раствором до такой концентрации, чтобы в единицу времени в канале датчика находилась только одна клетка. Однако при плохом перемешивании (гомогенизации) образца крови перед исследованием возможно возникновение такой ошибки даже при правильном подборе разведения.
Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов. Небольшие по размерам клетки (тромбоциты) генерируют импульсы низкой амплитуды, а сравнительно большие клетки (лейкоциты, эритроциты) – импульсы высокой амплитуды. Устройство, называемое «дискриминатор», разделяет амплитуды импульсов по величине, что и дает возможность отдельно подсчитать количество тромбоцитов и эритроцитов. Поскольку размеры лейкоцитов близки к размерам эритроцитов и их не удается выделить указанным методом, они неизбежно будут влиять на подсчет эритроцитов. Однако за исключением явных лейкоцитозов (> 50х109/л), это влияние будет незначительным, так как в норме концентрация эритроцитов в крови на 3 порядка превышает концентрацию лейкоцитов. В то же время при подсчете количества лейкоцитов необходимость разрушения эритроцитов очевидна. Эта задача легко разрешима, так как свойства мембран лейкоцитов и эритроцитов существенно различаются, и эритроциты легко лизируются под воздействием многих поверхностно-активных веществ (ПАВ).
Под воздействием тех же ПАВ различные формы лейкоцитов претерпевают сжатие (изменение размеров) разной степени, что и лежит в основе их разделения кондуктометрическим методом на три основные популяции: гранулоциты, лимфоциты и так называемые средние клетки. В область малых объемов (35-90 фл) попадают лимфоциты, которые значительно уменьшаются в размере. Гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы), напротив, подвергаются небольшому сжатию и расположены в области больших объемов (120-400 фл). Между двумя пиками имеется зона средних клеток, которая лучше всего соотносится с моноцитами (по этой причине в некоторых анализаторах эти клетки указываются как моноциты). Однако при измерении клеток кондуктометрическим методом в зону средних клеток могут попадать также базофилы и эозинофилы, особенно если они частично или полностью дегранулированы, поэтому более корректным названием параметра следует считать «средние» клетки (MID), а не моноциты, и учитывать этот факт при работе с результатами ОАК, полученными на анализаторе с тремя дифференцировочными зонами для лейкоцитов без морфологического изучения формулы крови.
Таким образом, кондуктометрический метод позволяет определять большинство эритроцитарных и тромбоцитарных показателей, связанных с объемом клеток, а также является основой для трехчленной дифференцировки лейкоцитов. В анализаторах последнего поколения вышеописанный метод объединен с использованием различных дифференцировочных лизатов, лазерного светорассеивания, радиочастотного анализа, иммуноцитохимического метода, что значительно расширяет возможности исследования и позволяет определять до 30 параметров крови, включая полный анализ лейкоцитарной формулы и подсчет ретикулоцитов.
Результаты автоматического гематологического анализа представлены в виде цифровых значений (абсолютных или относительных), а также графически – в виде гистограммы распределения клеток по объему. Гистограммы, предоставляющие дополнительную информацию, рекомендуется рассматривать параллельно с цифровыми значениями, они обязательно должны присутствовать на бланке исследования.
Материал для проведения общего клинического анализа крови
Венозная кровь считается оптимальным материалом для клинического исследования. Это обусловлено тем, что при известной стандартизации процессов забора, хранения, транспортировки крови удается добиться минимальной травматизации и активации клеток, примеси других веществ (тканевой жидкости), при этом всегда имеется возможность повторить и/или расширить анализ.
Пункция кожи с целью получения капиллярной крови является процедурой выбора в тех ситуациях, когда получение венозной крови невозможно (у новорожденных, ожоговых больных, при выраженном ожирении, спавшихся венах). Однако следует помнить, что при прохождении капиллярной крови через поврежденную ткань активируются процессы свертывания крови, а с тканевой жидкостью в образец попадает большое количество тромбопластина, что влечет за собой образование в пробирке микросгустков.
Что касается нормальных значений основных показателей крови, то в литературе нет указаний на какие-либо достоверные различия в клеточном составе венозной и капиллярной крови, а также в концентрации гемоглобина и СОЭ.
При выборе гематологического анализатора следует учитывать ряд факторов:
- Измеряемые параметры
- Метод исследования
- Производительность прибора
- Автоматическая или полуавтоматическая подготовка проб
- Объем пробы
- Реагентная база
- Удобная система выдачи информации
- Наличие программы контроля качества
- Совокупная стоимость владения
Кроме того, существует ряд факторов, которые чрезвычайно трудно объективизировать. Например, таким фактором является эргономичность и простота работы с прибором. Однако существуют несколько показателей, свидетельствующих о том, что прибор будет удобен в работе: наличие штативов для пробирок, автоматическое доразведение и повторный анализ проб при наличии определенных флагов, автоматическая промывка самплера и т.д. Поэтому следует тщательно изучить все особенности прибора и запросить официальные спецификации производителя.
- Измеряемые параметры
В первую очередь, при выборе анализаторов необходимо определиться с потребностями лаборатории. Выбор того или иного анализатора определяется в зависимости от структуры заболеваемости и специализации лаборатории. При этом у лаборатории могут возникать как стандартные, так и специфические требования, например, может возникнуть необходимость определить на гематологическом анализаторе С-реактивный белок или содержание гемоглобина в ретикулоцитах.
В целом весь ряд гематологических анализаторов по виду выполняемых исследований можно разделить на четыре типа.
- К первому типу относятся приборы, выполняющие анализ по небольшому числу показателей, обычно по 6-8, и без дифференцирования лейкоцитов на субпопуляции.
- Ко второму классу следует отнести 16-20-параметровые анализаторы, способные дифференцировать лейкоциты на три субпопуляции.
- К третьему классу относятся так называемые 5DIFF системы, способные дифференцировать лейкоциты по 5 популяциям и позволяющие определять до 28 параметров.
- И, наконец, особой функцией, не всегда включаемой в стандартную комплектацию анализатора, а иногда поставляемой отдельным модулем, является возможность дифференцирования ретикулоцитов. Общее количество параметров, определяемых анализаторами с таким модулем доходит, до 40.
Количество показателей в пределах группы зависит, прежде всего, от дополнительных возможностей анализаторов, таких, например, как выявление атипичных лимфоцитов или больших незрелых клеток, С-реактивного белка и т.д. Кроме того, следует учитывать, что не все показатели напрямую измеряются анализатором, многие из них являются расчетными, таким образом, количество показателей, определяемых приборами одного класса, может варьировать.
Отличие между системами первого и второго классов в настоящее время незначительно как по технологии измерения, так и по цене . Некоторые приборы допускают модернизацию из первого класса во второй уже после установки и запуска прибора.
-
Метод исследования
Основные гематологические показатели
RBC (Red Blood Cells) - число эритроцитов в единице объема, обычно в 1 л. Нормальные значения 3,9 - 5,0 х 1012 . Значения ниже 3,5 х 106 указывают на наличие анемии .
Кровь, в которой подсчитываются эритроциты, предварительно разводится прибором и содержит, кроме эритроцитов, еще лейкоциты и тромбоциты. Поскольку содержание красных клеток значительно превышает количество лейкоцитов, этим фактором пренебрегают и лейкоциты подсчитываются вместе с эритроцитами.
WBC (White Blood Cells) - число лейкоцитов в единице объема, обычно в 1 л. Нормальные значения колеблются от 4,0 до 9,0 х 109 . Значения ниже 4,0 х 109 указывают на наличие лейкопении , выше 10 x 109- лейкоцитоза . Подсчет лейкоцитов осуществляется прибором после лизиса эритроцитов.
PLT ( Platelet ) - число тромбоцитов в единице объема, обычно в 1 л. Нормальные значения 150 - 400 х 109 . Значения ниже 150 х 109 указывают на тромбоцитопению . Автоматические счетчики крови анализируют тромбоциты и эритроциты в одной камере без предварительной обработки.
HGB (Hemoglobin) - концентрация гемоглобина. В большинстве автоматических анализаторов показатель определяется спектрофотометрически гемоглобинцианидным методом. Нормальные значения 110-160 г/л.
HCT (Hematocrit) - гематокрит - часть объема крови, приходящаяся на долю эритроцитов. Обычно выражается в %.
MCV (Mean Corpuscular Volume) - отношение объема эритроцитов к их числу в определенном объеме крови. Показатель МС V изменяется в течение жизни. МС V ниже 80 фл оценивается как микроцитоз, выше 95 - как макроцитоз.
В автоматических счетчиках MCV вычисляется делением суммы клеточных объемов на число эритроцитов.
MCH (Мean Corpuscular Hemoglobin) - c реднее содержание гемоглобина в эритроците. Вычисляется в абсолютных единицах делением величины концентрации гемоглобина на число эритроцитов. Этот параметр определяет среднее содержание гемоглобина в отдельном эритроците и аналогичен цветовому показателю, но более точно отражает его уровень в эритроците.
МСНС (Мean Corpuscular Hemoglobin Concentration) - количество гемоглобина (в г) в 100 мл эритроцитов (36 г в 100 мл - предельная загрузка эритроцита гемоглобином при нормальном объеме клетки). Большее количество гемоглобина в эритроците возможно в результате увеличения его объема. МСНС представляет собой не процент, а отношение веса к объему, касается не одного эритроцита, а 100 мл эритроцитарной массы.
RDW (Red Cell Distribution Width) - распределение эритроцитов по размерам. RDW дает количественную оценку разброса эритроцитов по объему, т.е. наглядно в цифрах помогает оценить степень анизоцитоза. Гистограмма графически отражает частоту встречаемости эритроцитов разного объема. Обычно гистограмма имеет унимодальную форму, т.е. форму одиночного пика. При увеличении RDW гистограмма становится более широкой в основании с сохранением формы. При некоторых заболеваниях гистограмма может иметь более сложную форму.
МРV (Mean Platelet Volume) - средний объем тромбоцитов - этот показатель дает информацию о размерах тромбоцитов (макро или микротромбоцитопения). У практически здоровых лиц MPV находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов. MPV увеличивается с возрастом.
РСТ (Platelet Crit) - тромбоцитарная масса или тромбокрит - отражает процент количества тромбоцитов от массы цельной крови . Этот показатель вычисляется либо суммированием прямо измеренных объемов тромбоцитов, либо умножением среднего объема тромбоцитов на их содержание в единице объема крови.
PDW (Platelet Distribution Width) - распределение тромбоцитов по размерам - коэффициент вариации кривой распределения тромбоцитов. Основными методами измерения для приборов первого класса является кондуктометрия для подсчета клеток и цитохимия для определения уровня гемоглобина. Еще недавно исключительным методом для такой дифференциации было лазерное светорассеяние. Однако в последнее время совершенствование технологий, и в том числе применение методик не лазерного светорассеяния, позволяют добиться результатов, сопоставимых с результатами, получаемыми на приборах, основанных на лазерном принципе подсчета. Это обстоятельство существенно изменило ценовую ситуацию в данной популяции приборов, что позволило производить приборы с хорошими характеристиками и достаточно низкой ценой.
Для определения субпопуляции ретикулоцитов используется лазерная флюороцитометрия, которая в некоторых приборах дополняется цитохимией для выявления дополнительных параметров. Следует учитывать, что большинство фирм-производителей в технических спецификациях указывают не только методы детекции, но и другие технологии, используемые прибором, например, методы разведения или лизиса клеток. Кроме того, приборы могут дополняться и другими каналами, например, для определения CRP используется турбодиметрия
Границы нормальных значений для гематологических показателей
Параметры | Единицы измерения | Интервал значений |
WBC | 109/мкл | 4.0 - 9.0 |
Лимфоциты | % | 19 - 37 |
| 109/мкл | 1.2 - 3.0 |
Моноциты | % | 3.0 - 11.0 |
| 109/мкл | 0.1 - 0.6 |
Гранулоциты | % | 47 - 72 |
| 109/мкл | 2.0 - 5.5 |
RBC | 1012/л | 3.9 - 5.0 |
HGB | г/л | 110 - 160 |
HCT | % | 36 - 48 |
MCV | фемтолитр(10-15л) | 75 - 95 |
MCH | пикограмм (10-12г) | 24 - 34 |
MCHC | г/дл | 30 - 38 |
RDW | % | 11.5 - 14.5 |
PLT | 109/л | 150 - 400 |
MPV | фемтолитр(10-15л) | 7.4 - 10.4 |
PCT | % | 0.15 - 0.40 |
PDW | % | 10 - 20 |
-
Производительность
Помимо структуры исследований важным вопросом является производительность приборов. Приборы первых двух классов производят до 60 анализов в час. Приборы старшего класса имеют производительность от 60 до 120 анализов в час. Скорость работы приборов лимитирована как самой методикой исследования, так и особенностями подготовки проб. -
Пробоподготовка
По способу подготовки проб гематологические анализаторы делятся на две большие группы.
К первой относятся полуавтоматические анализаторы, в которых подготовка проб отделена непосредственно от анализа и производится в специальных приборах - дилютерах. Использование такой раздельной схемы приводит как комтаминации проб, так и к значительному увеличению времени на их подготовку.
Вторая группа - полностью автоматические анализаторы - в свою очередь делится на еще две группы. Приборы первой группы позволяют работать только с предразведенной кровью, вторая группа анализаторов может работать непосредственно с цельной кровью. Для гематологического анализа может использоваться как капиллярная, так и венозная кровь. Использование венозной крови с точки зрения аналитической точности более предпочтительно. Однако возможность широкого применения анализа венозной крови ограничивается отсутствием в обращении закрытых систем взятия материала и высокой инвазивностью самой методики взятия крови.
Некоторые анализаторы, обычно старших классов, позволяют работать с венозными пробирками, не открывая крышки. Это возможно благодаря использованию специальных штативов, позволяющих анализатору работать в нужном режиме. Другие анализаторы работают с открытыми пробирками, что позволяет собирать кровь как из венозной, так и из капиллярной пробирки. Некоторые системы оборудованы мини-штативами, которые позволяют сочетать оба метода.
-
Объем пробы
Современные гематологические анализаторы используются для анализа от 10 до 300 микролитров цельной крови. Более низкие объемы крови позволяют использовать систему в педиатрии, а также более экономно расходовать кровь, что дает возможность проведения повторных исследований. Кроме того, более низкие объемы проб снижают потребление реагентов. -
Реагентная база
Помимо подготовки проб большое значение имеет реагентная база. Количество разных реагентов, используемых анализатором, существенно влияет на себестоимость и качество исследований. Анализаторы младших классов могут работать как реагентами, произведенными фирмой-изготовителем, так и с реагентами других производителей, что обычно не сказывается на аналитическом качестве исследования, но может существенно повлиять на работоспособность прибора.
Статистически показано, что анализаторы, работающие на реагентах сторонних производителей, чаще ломаются и требуют большего внимания инженеров, кроме того, многие поставщики отказываются от технического обслуживания анализаторов в том случае, если лаборатории используют сторонние реагенты. На некоторых анализаторах установлены специальные защитные системы, не позволяющие использовать сторонние реагенты. Важной является возможность поставки безцианидных реагентов, используемых в цитохимической части исследования.
-
Система представления информации
Другим важным аспектом при выборе анализатора является формат представления результатов. Обычной формой предоставления результата являются абсолютные и относительные показатели, а также гистограммы и флаги. Использование флагов и гистограмм существенно упрощает расшифровку результатов анализа. Наличие у приборов специальных интерфейсов, позволяющих выводить информацию на принтер, внутри лабораторную сеть или отдельно стоящий компьютер, является в настоящее время обязательным требованием. Также важным является сохранение результатов исследования в памяти прибора. -
Совокупная стоимость владения
Наконец, при выборе анализатора большое значение имеет его стоимость. Однако помимо непосредственно стоимости анализатора, стоит обратить особое внимание на стоимость реагентов и расходных материалов. Расчет спецификации, особенно для приборов имеющих возможность выбора режима работы (CBC/5DIFF/RET), достаточно сложен и лучше, если его осуществит менеджер компании поставщика. При этом стоит обращать внимание на то, учтены ли в расчетах все режимы работы анализатора (анализ, Start-up, Stand-by, Autocleaning), включены ли в стоимость контроли и расходные материалы (например, пробирки) в необходимых количествах.